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    Les Plateformes / Imagerie Cellulaire : Microscopie électronique / Documents - formulaires / Protocoles Détaillés Sneack F vBy e Versace Francesca Women 2WID9YEH / Isolement
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    TRES IMPORTANT:

    Le traitement des cellules ou le prélèvement  du tissus à étudier doit être le plus rapide possible afin d'éviter la dégradation de la morphologie.

    Les échantillons doivent être de petite taille. Au maximum 1mm d'épaisseur.

    La zone à étudier doit être reperée et isolée dés le début du processus.

    Virus et structures isolées: la suspension virale, ou une solution contenant la structure à étudier (lysat de mitochondries, exosomes, etc.) est déposé quelques minutes sur une grille spécialement préparée (recouverte d'un film de formwar sur lequel nous avons pulvérisé du carbone). La grille est séchée sur la tranche. Après trois lavages la grille est colorée par les techniques de coloration négative, et prête pour l'observation. Cette technique permet aussi de réaliser des marquages immunologiques.

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    Cellules isolées:
    l'étude de cellules isolées ne pose pas de problème si on respecte quelques règles simples:

    • Une quantité minimale : 1à 10 millions de cellules, cela va dépendre de la taille des cellules. Le culot doit être impérativement d'au moins un millimètre au fond d'un eppendorf pour être exploitable en microscopie électronique, et attention aux pertes pendant les lavages. certaines cellules peuvent coller aux parois.
    • Attention à ne pas activer les cellules "sensibles" (cas des plaquettes sanguines par exemple)
    • La fixation s'effectue dans au moins 1ml de fixateur, 1heure à température ambiante.
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    • 3 lavages sont nécessaires, par cycles de centrifugation.
    • Dans les cas des cellules issues de culture, il est primordial de laver les cellules en milieu sans sérum avant fixation. Sans cela il y a risque de précipitation des protéines du milieu de culture.
    • Le culot ne doit JAMAIS être sec.

    Le cas particulier des cellules adhérentes peut poser problème: les méthodes de décollement, trypsine ou grattage, sont susceptible d'abimer les cellules, ainsi que de diminuer le marquage de la membrane. Dans ce cas il n'y a pas de véritable bonne solution, et il est nécessaire de tester les différents protocoles pour trouver le moins destructeur. Après décollement, le protocole est le même que pour les cellules isolées.

    Il existe néanmoins une solution, qui permet de répondre aussi au problème de cellules disponibles en petites quantités: il s'agit de déposer les cellules sur des lamelles de verre, et de réaliser l'inclusion sur ce support. L'échantillon sera alors inclus en monocouche en résine. Cette technique permet donc d'étudier la morphologie de cellules rares et/ou accrochée à un substrat (verre, plastique, d'autres cellules, filtre) et de réaliser des marquages avant inclusion.

    Il faut savoir aussi qu'il y a toujours le risque de perdre des cellules au fur et à mesure de l'inclusion. Il est donc aussi pour cela important d'avoir une bonne quantité de matériel au départ ainsi que de choisir des tubes qui ne retiennent pas les cellules.

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    Le premier facteur clef de l'isolement des tissus est la rapidité . plus vite l'échantillon sera dans le fixateur, meilleure sera la préservation de son ultrastructure.

    Le deuxième facteur important est la taille de l'échantillon. Pour des raisons inhérentes à la technique (en particulier la nature des fixateurs chimiques utilisés et la taille des outils de coupe et d'observation), la taille en est obligatoirement réduite pour la microscopie électronique. Dans une de ces dimensions le fragment de tissus doit être inférieur à 1mm. Dans le cas d'un échantillons trop épais, les zones situées en profondeur ne seront pas fixées et la morphologie en sera fortement dégradée.

    Le troisième point est d'avoir une réflexion préalable sur le but de l'étude en microscopie électronique. En effet, la contrepartie à un grossissement qui va de X3000 à X80000 est une zone observable réduite en surface. Il sera possible de voir la structure des organites, l'état du noyau, les membranes, voire de grosses macromolécules, mais impossible d'étudier un échantillon au niveau tissulaire. Il faut donc dés le prélèvement penser à repérer la zone intéressante pour l'isoler et ainsi faciliter et accélérer l'étude. En bref, il vaut mieux la chercher maintenant qu'au moment de la coupe ultrafine.

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    Un dernier point : dans certains cas, il peut être intéressant d'envisager une perfusion de l'animal entier avec le fixateur. Les tissus fragiles et/ou difficiles d'accès seront ainsi mieux préservés. Cette méthode est par exemple indispensable pour l'étude du cerveau, organe hétérogène, fragile et difficile d'accès.

    Protocole pour tissus:

    • Déterminer à l'avance la zone à étudier.
    • Prélever le tissus.
    • Dans le mesure du possible couper l'échantillon pour lui donner la taille idéale.
    • Le laisser une heure dans le fixateur à température ambiante.
    • Laver trois fois cinq minutes en tampon phosphate 0,1M
    • Si l'inclusion immédiate est impossible, l'échantillon peut attendre une nuit à 4°C dans le tampon.
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